細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制

【實驗?zāi)康摹?/strong>
1. 掌握DMEM培養(yǎng)基、胰酶的配制
2. 學(xué)習(xí)針頭濾器的使用方法
【實驗原理】
一．細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件
1. 氣體環(huán)境
    氣體是細(xì)胞生存的必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量和合成各種成分。二氧化碳主要維持培養(yǎng)基的pH，并作為碳源。一般用5%的空氣和5%CO2來提供動物細(xì)胞的氣體生長環(huán)境。氧分壓過大，不利于細(xì)胞生長。植物組織或細(xì)胞一般不需要額外提供CO2。
2. pH環(huán)境
    細(xì)胞生長的pH環(huán)境為：7.2-7.4，不同細(xì)胞有所差異。一般細(xì)胞耐酸性比耐堿性大些。         CO2對培養(yǎng)基pH的影響： CO2是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物， CO2的釋放必然會影響培養(yǎng)基的pH。
CO2 + H2O     H2CO3    H+ + HCO3-
    所以，培養(yǎng)基中要加一些緩沖劑，以保持 pH的穩(wěn)定，如 NaHCO3 、HEPES等
3. 糖類
葡萄糖------細(xì)胞的主要營養(yǎng)物質(zhì)，為生命活動提供能量
糖類在生物體內(nèi)的功能不僅僅是提供能量，與蛋白質(zhì)和脂類共同構(gòu)過程結(jié)構(gòu)材料和生物活性物質(zhì)。
體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基中都以葡萄糖作為能源材料，根據(jù)不同細(xì)胞的代謝特點，所加葡萄糖濃度有所不同。植物細(xì)胞培養(yǎng)一般以蔗糖作為能源物質(zhì)。
4.氨基酸
       所有細(xì)胞多需要以下12種氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸        另外所有細(xì)胞都需要谷氨酰胺，其具有特殊作用—促進氨基酸進入細(xì)胞膜，參與核酸合成，也是能源和碳源。
5.維生素
   在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)作用，雖然所需甚微，但為機體正常代謝不可缺少。
6.促生長因子
   培養(yǎng)基中除上述營養(yǎng)成分外，還需要促細(xì)胞生長因子，已知有許多激素具有促細(xì)胞增殖作用。
   血清是提供促細(xì)胞生長因子和其他細(xì)胞所需物質(zhì)的來源。
二．天然培養(yǎng)基與合成培養(yǎng)基
1.天然培養(yǎng)基
常用的天然培養(yǎng)基有血清、血漿、水解乳蛋白和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）、鼠尾膠原等。
優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好
缺點：來源受限。
       成分復(fù)雜，影響某些實驗產(chǎn)物的提取和結(jié)果的分析
       易發(fā)生支原體污染
2.合成培養(yǎng)基
合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如DMEM、 RPMI-1640、 TC199、MEM等。
合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。
    優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低
    缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。
培養(yǎng)基的主要種類（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）：
    單純的基礎(chǔ)人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基
完全培養(yǎng)基的組成
     基礎(chǔ)培養(yǎng)基                     80％一95％
     血清                           5％一20％
     碳酸氫鈉                       2.0 g/L
     青、鏈霉素                     各100單位／毫升
血清的功能：提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、提供貼壁及擴展因子、激素及各種生長因子，有一定的保護作用無血清培養(yǎng)基
三，消化液
1.胰酶溶液：0.1-0.25% ,pH一般在8左右，受Ca2+、Mg2+、血清的抑制。
胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。
胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。
胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks緩沖液配制,常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。
胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。
用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用
2.EDTA溶液：解離細(xì)胞，0.02%，可以和胰酶混合使用                                  #p#分頁標(biāo)題#e#
3.膠原酶溶液：用于上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，作用于膠原，
                          對細(xì)胞影響很小。
4.pH調(diào)整溶液：常用的有HEPES和NaCO3
5.谷氨酰氨補充溶液：**好配成100´ 的母液
6.抗生素溶液：常用青霉素和鏈霉素（雙抗），配成 100´ 的溶液
四．培養(yǎng)基的選擇：
比較不同的培養(yǎng)基的細(xì)胞生長曲線、生長狀態(tài)、集落形成率等，選擇**佳培養(yǎng)基
建立某種細(xì)胞株的培養(yǎng)基，通常也是**培養(yǎng)基
根據(jù)細(xì)胞的特點、實驗需要，查閱文獻、詢問同行**等
【實驗步驟】
(一） DMEM培養(yǎng)基的配制
1. 三袋DMEM粉末用雙蒸水溶解（先加入2/3DDW，再用DDW沖洗袋子）、磁力攪拌器攪拌半小時以上。
2. 加入1.2g/袋 NaHCO3定容3000 mL、攪拌30分鐘。
每人在超凈臺內(nèi)用大濾器過濾、分裝、寫好種類、名字。（留取少許做污染測試放CO2培養(yǎng)箱72小時）
3. 每8個人為一組，每人過濾90 mL，其余的過濾到100 mL試劑瓶中，每瓶90mL培養(yǎng)基備用。
使用前在超凈臺內(nèi)加入56℃滅活好的FCS 10 mL，使血清的終濃度為10%，4℃保存待用。
（二）胰酶的配制
1. 取實驗一中準(zhǔn)備好的D–Hanks 液 200 mL （8人一組）
2. 稱取0. 5g胰酶（0.25%）放入研磨器中并加入少量D –Hanks液成為糊狀，研磨200次，再加入D –Hanks液終體積為200ml，合并胰酶，加0.02%EDTA助消化，磁力攪拌使之完全溶解。（8人一組，分別研磨，再合并）
3. 用NaHCO3 調(diào)pH**8.0。
4. 小濾器（實驗一中已濕熱滅菌過的）過濾除菌**小瓶內(nèi),(不能裝的過滿,防止冷凍后瓶爆裂)、檢查濾器、貼好標(biāo)簽、-20℃保存。每人過濾20 mL 。
（注意：1.擰緊濾器2.注射器吸液體3.注射器插好濾器4.對著燒杯慢推壓針芯看是否漏5.如不漏對小瓶過濾。6.濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復(fù)多次，濾完。7.檢查濾器濾膜是否完好。）
【實驗結(jié)果】
配胰酶的時候因為研磨不好又做了一次。
【思考題】
1.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血清？
答：加血清是為了：提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、提供貼壁及擴展因子、激素及各種生長因子，有一定的保護作用無血清培養(yǎng)基
2.使用血清需注意哪些方面？
答：血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。
常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量**好。
優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。
血清的滅活（消除補體活性）：56 ℃ ，30 分鐘
血清的消毒：過濾除菌
3.消化液胰酶的濃度是多少？
答：濃度是0.25％
4.使用小濾器過濾要注意哪些？
答：小濾器要滅菌后使用；
一般適合于少量液體過濾，液體量不能過多；
有些有機物質(zhì)可以溶過濾器的膜，所以小濾器不適合過濾有機物；
使用前要用推注氣體的方法檢驗過濾膜是否完好無存。

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