器材 ：
液氮冷凍灌、 恒溫培養(yǎng)箱、 電冰箱、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、 離心機(jī)、 分析天平、倒置顯微鏡、 超凈工作臺(tái)、彎頭吸管（1個(gè)）、膠頭滴管（9個(gè)）、  離心管（9個(gè)）、 帶塞培養(yǎng)瓶（不定個(gè)）、 試管架、 量桶、 燒杯、酒精燈、 抽濾瓶、G6型號(hào)細(xì)菌過(guò)濾漏斗、帶塞小玻璃瓶，大三角瓶 、無(wú)菌凍存管、液氮瓶。
試劑 ：
RPMI l640培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液， 小牛血清（生長(zhǎng)因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇（消毒）,凍存培養(yǎng)液（培養(yǎng)液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS緩沖液或hanks液等。
器皿的消毒及準(zhǔn)備：
1、玻璃器皿的清洗滅菌（5％鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml）：
（1）浸泡:新使用或重復(fù)使用的玻璃器皿須經(jīng)5％鹽酸溶液或自來(lái)水浸泡過(guò)夜或煮沸30min，水洗。以去除新購(gòu)進(jìn)玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質(zhì)，并消除其弱堿性。
（2）刷洗:浸泡后用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)的洗潔精進(jìn)行刷洗。刷洗后經(jīng)行烘干。
（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當(dāng)晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋?zhuān)绊懶Ч⒉Ａе破吠耆萑肭鍧嵰褐?4h。清潔液具有極強(qiáng)酸蝕作用，操作過(guò)程需戴防護(hù)用具。
（4）沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來(lái)水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿(mǎn)自來(lái)水、倒掉反復(fù)10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次，將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干凈透明，無(wú)油煙，不能殘留任何有害物質(zhì)及化學(xué)藥品等。
（5）包裝滅菌:器材經(jīng)清洗烤干或晾干后，先應(yīng)嚴(yán)格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。
2、橡膠制品清洗消毒：
0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5mol/L HCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用
3、塑料制品的清洗消毒（瓶蓋、離心管）：
使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來(lái)水過(guò)夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡24小時(shí)，晾干備用。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作:
操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用酒精消毒。用紫外線(xiàn)消毒實(shí)驗(yàn)室空氣、工作臺(tái)面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進(jìn)無(wú)菌室前或做完實(shí)驗(yàn)后，均應(yīng)開(kāi)燈照射30min進(jìn)行消毒。紫外線(xiàn)照射60min可以消滅空氣中大部分細(xì)菌。
細(xì)胞復(fù)蘇：
凍存細(xì)胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必須快速冷凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，致使細(xì)胞死亡。在凍存細(xì)胞的保存管中含有對(duì)細(xì)胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應(yīng)馬上將其去除。在冷凍活化前應(yīng)在無(wú)菌臺(tái)上將細(xì)胞培養(yǎng)液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37℃的溫水中快速使細(xì)胞解凍。解凍后懸液快速移入培養(yǎng)液中混勻，離心去掉上清液，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液。
實(shí)驗(yàn)人員穿上無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)
（1）取一15ml離心管用滴管在其內(nèi)滴加5--9ml培養(yǎng)液（取8ml）。                                                                                            
（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入37℃水浴，不時(shí)搖動(dòng)，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開(kāi)蓋子，用吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入上述離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來(lái)）。
（4）低速離心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培養(yǎng)液再清洗離心一次。
（5）離心后倒掉上清液，在離心管中滴加3ml培養(yǎng)液（RPMI-1640），混勻（可用滴管輕柔吹打）。
（6）將離心管中的混合液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)瓶中滴加15滴10%小牛血清，蓋上瓶蓋，標(biāo)好細(xì)胞種類(lèi)和日期、培養(yǎng)人姓名等，將培養(yǎng)瓶平放，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換一次培養(yǎng)基。
細(xì)胞傳代：
當(dāng)觀察到培養(yǎng)瓶中細(xì)胞鋪滿(mǎn)度為90%時(shí)（細(xì)胞生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期時(shí)），解凍復(fù)活成功后的細(xì)胞要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過(guò)程稱(chēng)之為傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞細(xì)胞株的**大利處在于提供了大量持久的實(shí)驗(yàn)材料，便于實(shí)驗(yàn)。
（1）試驗(yàn)臺(tái)的消毒工作準(zhǔn)備好，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS液（不含鈣，鎂離子）洗1-2次，以免剩余培養(yǎng)液影響胰蛋白酶活性。（細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)）。
（2）向瓶?jī)?nèi)加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，1--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化（將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，以保證細(xì)胞沒(méi)有脫壁）。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
備注：若細(xì)胞沒(méi)有脫壁，生長(zhǎng)良好，則直接倒掉消化液，加培養(yǎng)液8ml，離心收集細(xì)胞；若發(fā)現(xiàn)很多細(xì)胞已解離已脫壁（即解離過(guò)度），則直接加培養(yǎng)液進(jìn)行離心收集細(xì)胞。
（4）倒出消化液，向瓶?jī)?nèi)用滴管加入培養(yǎng)液少量（約2ml），輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再加3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清。
（5）使用吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以防用力過(guò)猛損傷細(xì)胞。
（6）將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，離心(1000r／min) 5min。
（7）將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養(yǎng)液，并反復(fù)吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。
（8）取3個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過(guò)火消毒。
（9）在培養(yǎng)瓶中各加入1ml細(xì)胞懸液、2ml培養(yǎng)液（用移液槍?zhuān)?5滴小牛血清，加好后酒精燈下過(guò)火加塞。
（10）細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來(lái)確定。一般2～3d后應(yīng)換一次生長(zhǎng)液。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。
細(xì)胞凍存：
細(xì)胞的凍存**常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護(hù)劑緩慢的冷凍細(xì)胞。由于細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下，細(xì)胞內(nèi)外水分會(huì)很快結(jié)成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度升高，PH值改變，部分蛋白質(zhì)因此變性使細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞。因此在細(xì)胞凍存時(shí)的關(guān)鍵是盡可能減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，故凍存時(shí)采用甘油或DMSO做保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量較小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，對(duì)細(xì)胞毒害作用小，梯度慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)水分滲出細(xì)胞外，減少形成冰晶對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的傷害。細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲(chǔ)存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。
（1）選對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞(細(xì)胞鋪滿(mǎn)度為90%左右時(shí))，在凍存前1d換液。
（2）試驗(yàn)臺(tái)的消毒工作準(zhǔn)備好，倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
（3）向瓶?jī)?nèi)加入1ml 0.25%胰蛋白酶液，以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。
（4）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進(jìn)行消化，1--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即中止消化。
（5）吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清，終止消化。
（6）使用彎頭吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以防用力過(guò)猛損傷細(xì)胞，按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液。
（7）將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，(1200r／min) 6min，去掉上清液。再加3ml培養(yǎng)液按常規(guī)方法形成細(xì)胞懸液。
（8）配制凍存培養(yǎng)液（培養(yǎng)液7ml，10%小牛血清2ml，10%DMSO 1ml），于離心管中加入1ml細(xì)胞懸液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻。
（9）將細(xì)胞懸液分裝入無(wú)菌凍存管中，每管1.5 ml（凍存液要先預(yù)冷到4℃ ）；在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者。
（10）凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增**-5℃～-10℃/ min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入液氮?dú)庵羞^(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。（操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷）。